体外诊断试剂校准品、质控品研究技术指导原则

附件一：

体外诊断试剂校准品、质控品研究技术指导原则

体外诊断试剂校准品（物）（包括真实度控制品）、质控品（物）（简称校准品、质控品）

是实现体外诊断试剂临床检测及监督检验结果准确一致的主要工具，也是保证量值传递的实物计量标准。校准品、质控品研究技术资料应包括产品技术要求、试验方法等重要信息，是指导注册申请人（简称申请人）单独申请注册校准品、质控品的重要技术性文件之一。

本研究技术指导原则根据国家食品药品监督管理局《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》、《医疗器械标准管理方法》、《生物制品规程》（2000 版）等相关规定，参考国际标准化组织（ISO）、美国食品药品监督管理局（FDA）、临床化学国际联合会（IFCC）等有关体外诊断试剂方面的指南，对编写的格式及各项内容的要求进行了详细的说明。其目的是为体外诊断试剂校准品、质控品单独注册申报进行原则性的指导，同时，也为注册检验及审评部门审核体外诊断试剂校准品、质控品提供参考。本指导原则并不适用于质控菌株。

由于校准品、质控品种类多、范围广、临床使用重要性强，因此，申请人应根据产品特点及临床使用目的编写技术资料，以便于关注者获取准确的信息。

申请人应提供申请注册校准品、质控品的产品标准和技术资料，技术资料的要求参见《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》。产品标准可参见本技术指导原则。

1 范围

应明确陈述本标准规范的对象和所涉及的方面，指明使用的范围。

2 规范性引用文件应包括引导语和规范性引用文件的一览表。

3 分类和组成及其它

3.1 组成成份

应说明校准品、质控品的主要组成成份及其生物学来源。

3.2 标示值

应注明校准品赋值及测量不确定度、质控品的赋值及参考范围，非定值质控品可通过标示目标浓度（如：低、高、中）来表示。

3.3规格

应注明校准品、质控品的包装规格。

3.4用途

应详细注明校准品、质控品的预期用途。

3.5稳定性

应提供至少一批成品在实际储存条件下保存至有效期后的稳定性、开瓶稳定性研究资料。特殊情况应予以说明，必要时应提供加速破坏性试验资料。该资料可放入产品标准的规范性附录中。

3.6校准品的溯源性、互换性，定值质控品赋值的统计学处理

应提供校准品的溯源性资料，计量学溯源链的说明应始于该产品的值，止于计量上最高参考标准。校准品如有互换性，应提供互换性研究资料。

应至少提供一批校准品靶值的赋值程序及测量不确定度资料，校准品如有互换性，应提供互换性验证时对其赋值进行统计学处理、修订的研究资料。

应至少提供一批定值质控品靶值的赋值程序、统计学处理、修订及可接受区间值的研究资料。

上述资料可放入产品标准的规范性附录中。

3.7生物安全性

生物源性基质（如血清、血浆、羊水等）的校准品、质控品需提供生物安全性资料。生物安全性检测应采用其国家权威管理机构认可的、且不低于我国法定用于血源筛查体外诊断试剂灵敏度的检测试剂，对校准品、质控品的 HBsAg、HIV抗体、HCV抗体等进行检测。该资料可放入产品标准的规范性附录中。

3.8校准品、质控品主要原材料、工艺及产品质量控制

对于按第三类产品申请注册的校准品、质控品，其主要原材料、工艺及产品质量控制研究资料应参照《生物制品规程》（2000版）编制。

境内校准品、质控品生产企业应具备相应的专业技术人员、相适应的仪器设备和生产环境。应持有《医疗器械生产许可证》，应当按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行。应当通过《体外诊断试剂生产企业质量考核评定标准（试行）》的考核。校准品、质控品生产过程中所用的各种原材料，涉及生物安全性时应按有关规定严格控制。境外企业应符合所在国的有关规定。

3. 8.1主要原辅料、包材质量控制该部分应列出主要原辅料、包材的质量控制要点。

3.8.1.1主要生物原料

与产品质量密切相关的主要生物原料，包括各种生物活性抗原、抗体、血清等，应注明来源，性质和质控指标等。应按照要求对其进行质量检验，达到规定的质量要求。

3.8.1.2生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括血清、血清白蛋白等。这类生物原料的质量标准应符合相关规定并适合本产品的要求。

3.8.1.3化学原料

应建立适合本产品的质量控制标准。亦可由供应商提供合格报告。

3.8.1.4包材

分装小瓶、铝箔袋、包装盒等都应建立适合本产品的质量控制标准。亦可由供应商提供合格报告。

3.8.2生产工艺控制

应注明本产品的生产工艺，列出关键工艺及质量控制要点。

3.8.3产品质量控制

应按照相关标准抽取规定数量的样品对其进行检测。

上述资料可放入产品标准的规范性附录中。

4 要求

4.1 外观

应注明校准品、质控品（如冻干品或干粉试剂复溶后）的外观。

4.2装量

校准品、质控品的最小包装单元中实际质量或体积（含检测人份数或试验次数）与标称

的应符合规定的要求。

4.3 校准品、质控品测量准确度校准品的测量准确度应满足计量学溯源性的要求，并符合产品规定的要求。

定值质控品和非定值质控品无溯源性要求，但该定值质控品应有可接受区间值的要求。

非定值质控品没有测量准确度要求。

4.4 均一性

校准品、质控品的均一性应满足国家相关技术规范的要求。

5 试验方法

5.1 外观

采用目测法。

5.2装量

使用通用量具测定装量，在装量为检测人份数或试验次数时可通过测试系统检测装量。

5.3测量准确度

5.3.1校准品测量准确度

应给出高一级同类量校准品校准下一级测量程序后测定该校准品的试验方法；

若无同类量校准品应给出由高一级测量程序赋值的特定校准物校准下一级测量程序后测定该校准品的试验方法；

采用多中心合作赋值的校准品，可选择其中1-2种方法对校准品进行测定；真实度控制品应给出为其赋值的试验方法。

在条件要求合理的情况下，校准品测量准确度亦可采用常规测量程序，以高一级同类量校准品作校准曲线后测定该校准品。

5.3.2定值质控品测量准确度

应至少给出一种用校准品校准测量程序后测定该定值质控品的试验方法。

5.4均一性

通常取同批号的一定数量最小包装单元的校准品、质控品，每包装单元测试1次，按

下面的公式计算测试结果的平均值（X₁）和标准差S₁；另用上述校准品、质控品中的1个

最小包装单元连续测试相同次数，计算测试结果的平均值（X ₂）和标准差S₂；按下列各公式计算瓶间重复性CV%，所有参数的瓶间重复性结果均应符合要求。最小装量不够完成瓶间差检测的可只进行批内精密度检测。

x_i公式 1 X  ⁱ^¹

公式 2 S 

公式 3 S_瓶间 S S

公式 4 CV_瓶间(%)  S_瓶间/ X₁100

当S₁<S₂时，令CV _瓶间=0 式中：

X ----平均值；

S----标准差；

n----测量次数； x_i----指定参数第i 次测量值。

6 检验规则

如有检验规则，应提供检验规则内容。

7 标志，标签、使用说明书

7.1包装、标签

应当符合《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》的要求。

包装、标签上必须包括产品通用名称、生产企业名称、产品批号、注意事项。亦可同时标注产品通用名称、商品名称和英文名。

7.2产品说明书

应按《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》的有关要求编写。

说明书中的产品名称包括通用名称、商品名称和英文名称。通用名称应当符合《体外诊

断试剂注册管理办法（试行）》中有关的命名原则。

8 包装、运输和贮存校准品、质控品的包装、贮存和运输应适合该产品的要求，并有利于其特性量值的稳定。

9 规范性附录

应列出标准正文附加条款及上述可放入本规范性附录中的资料。

* 注：二类体外诊断试剂校准品、质控品应参照本技术指导原则执行。

附件二：

发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则

发光免疫分析试剂是指利用特异的抗原抗体反应等生物学原理，利用发光信号来进行检测的一类试剂。主要包括化学发光（酶促、非酶促），电化学发光和时间分辨荧光等法。

该指导原则主要适用于用发光分析技术对蛋白质等被测物质进行检测的第三类试剂生产及质量控制。第二类试剂的生产及质量控制可参考该指导原则执行，国家食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。

（二）诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生产企业还应该通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

（三）诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生产和质量控制总体目标应保证产品使用安全，质量稳定，工艺可控，使用有效。

二、原材料质量控制

（一）主要生物原料

与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种活性抗原、重组抗原、单克隆抗体、

多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。一般按工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量要求。原料供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

1．外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清透明的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含有其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

2．纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效

液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜丙烯酸胺凝胶浓度进行电泳。一般情况下，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量的蛋白标准品作参照，采用合适的电泳电流，电压和电泳时间；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。

3．蛋白浓度蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。

4．效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

5．功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

（二）生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料、主要包括牛血清、

羊血清、牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》上规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。

建议作以下检验：

1. 牛血清或羊血清

外观：为浅黄色呈稍粘稠的液体，无溶血或异物无菌试验：将血清直接放37度培养7天，放在明亮处观察，不得出现混浊。总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，标准为不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清 1ml，加入 0.85%的 NaCl 溶液。加入饱和硫酸铵 1ml，置 4℃，

2 小时，8000rpm 离心 10 分钟，弃上清。沉淀溶于 0.85%NaCl 溶液，至 1ml，用 Lowry 方法测定蛋白含量，不能大于 2mg/ml。

2. 牛血清白蛋白：

外观：应为浅黄色冻干粉末无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18-26度时应不大于15分钟。1%水溶液的ｐＨ值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，质量标准为大于等于 95％。

总蛋白中的 BSA 含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA 的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的 BSA 含量，其标准为≥90%。

3. 酪蛋白：

酸度应符合生产所需的质量标准。

4．标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值

（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

（三）化学原材料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准》分析纯级别检验。主要的检测指标包括一些基本的一般盐类检测、溶液PH值、重金属检测、溶解情况的检测、干燥失重的检测。

炽灼残渣等。

1．无机类：主要包括有氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氯钠等。

2．有机类：主要包括有吐温20、三羟基氨基甲烷等。

3. 特殊化学原料：Eu-DTTA，鲁米诺等。

Eu-DTTA纯度分析与鉴定：要求Eu-DTTA各功能团符合分子结构，纯度在96%以上。

（四）其他原辅料

1．微孔板条

外观：明亮处用肉眼观察板条的外观质量应无划痕、破损、飞边、肮脏、表面光滑。板条与微孔反应条塑料框架应配合合适。

材质：微孔反应板条每孔加200µL增强液，用时间分辨荧光分析仪检测其荧光值，平均本底荧光值≤1500。

吸附能力和精密性：用一定浓度的蛋白包被微孔板条，检测荧光值，计算其CV值、批内差标准CV≤5％,批间差CV≤10％。

2．其他

粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。

三、试剂盒各组分的生产

诊断试剂盒主要组分的生产包括包被反应板、标记物制备、各种溶液的配置、冻干、分包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来完成。

(一)固相载体的制备（因不同产品使用的包被载体有很大区别，在此以标准 96 孔微孔反应板为例进行描述）

1．包被板的准备准备经检验合格的包被板，记录批号、数目、状态标识。

质控项目：尺寸，外观，包装。

2．包被液的配制

配制包被缓冲液，加入包被的抗体或抗原到工作浓度，混合均匀，即成所需的包被液，工作浓度的包被液应在规定时间内使用。

质控项目：包被缓冲液配方，pH 值，包被物成份。

3．包被板的包被

包被液按工艺要求加入包被板。记录所包被的包被板数量。质控项目：包被体积，温度，时间，过程监控。

4．洗板工作液的配制（按各单位工艺要求，可以不洗板）按配方配制洗板工作液。

质控项目：洗板工作液配方，pH 值。

5．封闭液的配制按配方配制封闭液。

质控项目：封闭液配方，pH 值。

6．洗板和封闭

包被完成后，抽去孔内包被液，用洗板工作液洗板后（按各单位工艺要求，可以不洗板），加入封闭液。

质控项目：封闭体积，温度，时间，过程监控。

质检项目：封闭前检验包被均一性。

7．抽干

封闭后的反应板，抽干孔内液体。

质控项目：过程监控。

8．干燥

反应板应按工艺的要求进行干燥。

质控项目：温度，湿度，时间，过程监控等。

9．密封包装将干燥后的反应板用铝箔袋密封包装，内放干燥剂（按各单位工艺要求，可以不放）。

质控项目：密封性能，标示及效期等。

10．反应板（半成品）检验

对装袋密封后的反应板进行抽样检验，外观、板内变异、板间变异。

(二)滴配过程

1．酶结合物的制备（根据各产品实际情况，该步骤可不进行）

采用常规过碘酸钠——乙二醇法将相关的抗体（或抗原）标记辣根过氧化物酶（或其他

酶），酶标记后的抗体（或抗原）应加入适当的保护剂保存于低温。质控项目：标记方法，过程控制。

2．酶结合物的鉴定

(1) 功能性实验

将酶结合物用酶稀释液稀释后，用于产品的滴配，其结果应符合相关试剂盒的质量标准。

(2) 稳定性

将酶结合物用酶稀释液稀释，进行 2-8℃，及热稳定性实验，滴配结果应符合相关试剂盒的质量标准。

3．酶结合物稀释液按酶结合物稀释液的配方配制，存放在 2-8℃保存，并于规定时间内使用。

质控项目：酶结合物稀释液配方，pH 值。

4．酶结合物工作浓度的滴配

取酶结合物，用酶结合物稀释液稀释到不同的浓度，用已制备好的反应板进行滴配。测定系列标准品及相应的质控品，确定使体系达到最优的酶结合物工作浓度。

5．酶结合物工作液配制将所需量酶结合物和酶结合物稀释液按滴配浓度混合均匀。

质检项目：分装前检验，用配套的反应板进行检验，外观、灵敏度、质控品测定值、定量产品应作校准品线性检测。

6．酶结合物工作液的分装按工艺要求分装酶结合物工作液。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

7．酶结合物工作液（半成品）检验

对分装后的酶结合物工作液进行抽样检验，外观、分装量、灵敏度、校准品剂量-反应曲线线性、质控品测定值。

(三) 校准品、阴阳性对照或质控品的制备

1．稀释液按稀释液的配方配制，存放在 28℃或-20℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：稀释液配方，pH 值。

2．校准品、阴阳性对照或质控品的配制

校准品、阴阳性对照或质控品的配制要具有溯源性，可参照国家标准品、WHO 标准品或其他级别的标准物质进行配制。

质检项目：分装前检验，准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

3．校准品、阴阳性对照或质控品的分装

按工艺要求分装校准品、阴阳性对照或质控品。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量。

4．校准品、阴阳性对照或质控品（半成品）检验

对分装后的校准品、阴阳性对照或质控品进行抽样检验，外观、分装量、准确性、剂量

－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

(四) 化学发光底物的制备

1．底物缓冲液按底物缓冲液的配方配制，存放在 2-8℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：底物缓冲液配方，pH 值。

2．化学发光底物（氧化剂和发光剂）的配制分别按氧化剂和发光剂的配方在底物缓冲液中加入相应的氧化剂和发光剂质控项目：氧化剂和发光剂配方。

质检项目：分装前检验，本底、发光强度。

3．化学发光底物（氧化剂和发光剂）的分装按工艺要求分装化学发光底物（氧化剂和发光剂）。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

4．化学发光底物（半成品）检验对分装后的化学发光底物进行抽样检验，外观、分装量、本底、灵敏度、发光强度。

（五）铕标记物的制备

针对不同的标记生物原料，确定不同的标记制备工艺，包括铕-DTTA 与标记生物原料的比例，标记温度和标记时间、标记得率的计算标准等。在实际操作过程中要求严格按照 SOP 进行操作

（六）冻干

各种冻干品都需建立各自的冻干工艺，冻干品外观应该呈现疏松的粉末状固体，具有一定的形状，复溶完全、迅速，呈澄清透明液体。

（七）分装、灯检和贴签

分装量用减重称量法进行测量，把质量换算成体积后进行分装量的控制。灯检是目测检查各组分的色泽、分装量以及是否混浊、有杂质等。

（八）包装

根据试剂盒包装 SOP 要求及说明书的要求，以流水线操作形式进行包装。包装时应严格检查品名、批号、装量，认真核对各物料数量，并在关盒前进行复核。

四、质量控制

（一）半成品质量控制

1．半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。

2．质控品的要求

用于半成品质量控制的质控品包括阳性样品符合率，阴性样品符合率，灵敏度（最低检出量），特异性，定量范围，定量曲线的线性，精密性，稳定性等指标，如具有国家标准品或参考品的产品应使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化的质控品进行检验。如无国家标准品（参考品），可采用企业质控品，但企业参考品质量标准不得低于国家药品监督管理部门已批准的同类产品的质量标准。

3．半成品检验

根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验，检验检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。

企业应对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作 37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

（二）成品质量控制

1．成品抽样产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。

质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批试剂的报批批量应至少为 10000 人份。

2．成品检验

一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到国家标准品（参考品）的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，但其质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批准的同类试剂的质量标准。

在批放行前，每一批化学发光类诊断试剂应完成 37℃热稳定性试验，试验结果应符合

产品的质量标准。

附件三：

酶联免疫诊断试剂生产及质量控制技术指导原则

酶联免疫诊断试剂是指在酶标板上包被相关的抗原（或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体或抗原的存在。

为了规范酶联免疫诊断试剂的生产和质量控制，制定本技术指导原则。

本指导原则适用于应用酶联免疫法的第三类诊断试剂（病原微生物）的生产和质量控制，其他类酶联免疫诊断试剂（如第二类等）参考本指导原则执行。国家药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）酶联免疫诊断试剂生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。

（二）酶联免疫诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围作出明确规定，并经国家药品管理部门批准。

（三）酶联免疫诊断试剂在研制时，应当遵循科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）酶联免疫诊断试剂生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

二、原材料质量控制

（一）主要生物原料

与诊断试剂的质量最密切相关的生物原料主要包括各种生物活性抗原、重组抗原、单克隆杭体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

1．外观

2．纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效

3．蛋白浓度蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。

4．效价效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

5．功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

（二）生物辅料生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料均应按照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》所规定的质量标准要求进行检验，达到相应的质量标准后方应用于生产。

建议作以下检验：

1. 牛血清或羊血清外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物无菌试验：将血清直接放37度培养7天，放在明亮处观察，不得出现混浊。

总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，标准为不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，加入0.85%的NaCl溶液。加入饱和硫酸铵1ml，置4℃，

2小时，8000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法测定蛋白含量，不能大于2mg/ml。

2. 牛血清白蛋白：

外观：应为浅黄色冻干粉末无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18-26度时应不大于15分钟。1%水溶液的ｐＨ值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，其标准为大于等于95％。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。

3. 酪蛋白：

酸度应符合生产所需的质量标准。

4．标记用酶

（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不得出现非特异性反应。生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

（三）化学原材料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

（四）其他物料

1．酶标板

⑴ 外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量。如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。

⑵ 吸附能力和精密性

用一定浓度的正常人IgG包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，双波长酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）读数。计算CV值，批内CV≤5％，批间CV≤10％。

2．液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

3．其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。

（五）企业质控品

企业质控品一般包括阴阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性（均一性）、

hook 效应等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批准的同类试剂的质量标准。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。三、试剂盒各组分的生产

酶联免疫诊断试剂盒主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

（一）各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或者分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应该在量值上具有溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的功能性实验及稳定

性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用的底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

（二）包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内置干燥剂），抽真空后，保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、湿度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

（三）分装和包装

样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行无菌处理后再分装，分装量的误差应小于5%。

分装及包装均应按照相应的 SOP 的要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

四、质量控制

（一）半成品质量控制

1．半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。

2．半成品检验

利用上一批检验合格的试剂盒的相应组分，对本批生产出的各种试剂盒组分分别进行检验，检验结果达到产品的质量标准。

半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业质控品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，但该企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批准的同类试剂的质量标准。

检测所抽样的半成品的试剂盒性能，包括阴阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、

精密性等，均应达到相应质量标准的要求，对精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂 CV 不得高于 20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和校准品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

（二）成品质量控制产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。

质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫诊断试剂报批批量应至少为10000人份。

⑴ 成品检验

一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到质控品的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，但其质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批准的同类试剂的质量标准。

⑵ 稳定性试验

在批放行前，每一批酶联免疫诊断试剂应完成 37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

附件四：

金标类诊断试剂生产及质量控制技术指导原则

金标类试剂是指应用胶体金免疫技术，采用胶体金标记的抗体或抗原包被于玻璃纤维膜、聚脂膜或其他载体，将相关抗原或抗体固相连接在硝酸纤维膜，应用层析法的原理检测样品中的抗原或抗体的快速检测试剂。

本技术指导原则适用于第三类体外诊断试剂中金标类试剂的生产及质量控制，其他金标试剂可作参考。国家药品监督管理部门将根据科学技术发展的需要对本技术指导原则适时组织修订。

一、基本原则

（一）研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量指标，并应符合有关法规的要求。

（三）诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

二、原材料质量控制

（一）主要生物原料

与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种活性抗原、重组抗原、单克隆杭体、

多克隆抗体以及多肽类生物原科。这类原料可用于胶体金标记、包被硝酸纤维膜及用于制备质控线的抗原或抗体等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

1．外观

2．纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜丙烯酸胺凝胶浓度进行电泳。一般情况下，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量的蛋白标准品作参照，采用合适的电泳电流，电压和电泳时间；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。

3．蛋白浓度蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。

4．效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

5．功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。用于制备制控线的抗原或抗体可采用其他适宜方法进行功能性实验。

（二）生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括牛血清白蛋白等。这些生物原料均应按照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》所规定的质量标准要求进行检验，达到相应的质量标准后方应用于生产。建议对牛血清白蛋白作以下检验：

外观：应为浅黄色冻干粉末无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18-26℃时应不大于15分钟。1%水溶液的pH值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，其标准为大于等于95%。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

（三）化学原材料

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量质量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

（四）其他物料

硝酸纤维素膜、玻璃纤维或聚酯纤维膜及滤纸、玻璃纤维膜等在购入时，其生产商必须提供该批次材料的质量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

1．硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜应具有厚度、孔径大小等要求，毛细迁移速度，韧性（切割时膜破损引起的废品率）、均一性（厚度偏差范围、毛细迁移速度偏差范围）应达到规定的要求。

2．玻璃纤维或聚酯纤维膜及滤纸

玻璃纤维或聚酯纤维膜及滤纸应具有厚度、毛细迁移速度、重量等要求，均一性（厚度偏差范围，毛细迁移速度偏差范围，重量偏差范围）应达到规定的要求。

3．玻璃纤维膜

适用于全血检测的金标试剂，过滤红细胞所用玻璃纤维膜或其他材料具有不吸附蛋白

质的特点，应具有厚度、孔径大小等要求。

4．塑料衬片

塑料衬片应具有厚度、硬度（切割时一次未能整条切下的百分率）、尺寸（与标识吻合）、粘性（切割时造成玻璃纤维与塑料衬片分离的百分率）等要求。

5．其他

粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。

三、试剂盒的制备

本类试剂的生产包括胶体金及胶体金标记抗原或抗体的制备，胶体金标记的包被，检测线及质控线的制备，胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定，各种工作溶液的配置等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

（一）胶体金标记物的制备

采用枸橼酸三钠还原法或其他方法制备胶体金，胶体金颗粒大小应符合规定，胶体金标记物在510560nm波长处应有最大吸收值，置28℃保存，应在规定的保存期内使用。采用合适的方法确定胶体金标记物、包被抗原或抗体工作浓度，将工作浓度的胶体金标记物吸附于玻璃纤维或聚酯纤维膜上。

（二）检测线及质控线的制备

取已确定使用浓度的相关抗原或抗体，在硝酸纤维素膜上制备检测线，应用同样方法制备质控线，根据生产工艺在规定的温度、湿度条件下干燥，置规定的湿度（通过验证方法确定相对湿度要求）条件下存放。检测线与质控线应具有间隔距离要求，应对所用的金标记用玻璃纤维及硝酸纤维素膜等进行质量检测，如尺寸、外观、包装及吸附性能等，并记录批号、数目、标识，不同批号的玻璃纤维及硝酸纤维素膜不能混用。

（三）贴膜、切割、装袋

贴膜、切割及装袋应在具有相应湿度（通过验证方法确定相对湿度要求）条件下操作，切割的膜条应有宽度要求。

四、质量控制用于半成品及成品质量控制的质控品包括灵敏度、特异性、均一性等指标，如具有国家标准品或参考品的产品应使用国家标准品（参考品）或经标化的企业质控品进行检验。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，但该企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批准的同类试剂的质量标准。

（一）半成品质量控制

1．半成品抽样

检验人员按批号抽取规定数量的半成品，作号标记，待检。

2．半成品检验

对所抽样的半成品做灵敏度、特异性、均一性等试剂盒性能方面的检测，应符合质量标准。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究，并制定相应的质量标准。稳定性试验可在在特定温度或特定条件下完成。

（二）成品质量控制

每一批金标试剂报批批量应至少为3000人份。

1．物理检查

应进行外观是否平整，材料附着是否牢固，液体移行速度，膜条宽度等物理检查，应符合质量标准。

2．性能方面的检测

灵敏度、特异性、均一性等试剂盒性能方面的检测，应符合质量标准。